Лаборатория биологии РНК и эпигенетики

Лаборатория создана в 2017 г. при поддержке «мегагранта» Правительства Российской Федерации для государственной поддержки научных исследований, проводимых под руководством ведущих ученых в российских образовательных организациях высшего образования, научных учреждениях, подведомственных Федеральному агентству научных организаций, и государственных научных центрах Российской Федерации (конкурс 2016 года, V очередь: http://p220.ru/phocadownload/win5.pdf); соглашение № 14.W03.31.0007 от 28 февраля 2017 г.).
Направление научного исследования: Молекулярные механизмы РНК-интеференции и защиты геномов у бактерий и эукариот.
Лаборатория оснащена современным оборудованием и активно сотрудничает с ведущими научными коллективами в России и за рубежом.

 
Основные задачи третьего этапа работ по тематике мегагранта:
 
3.1. Изучение взаимодействий РНК-связывающих белков с клеточными РНК. Анализ взаимосвязи между структурой хроматина и составом белков, связанных с синтезируемой РНК. Разработка и тестирование высокопроизводительных методов анализа пост-транскрипционной судьбы клеточных РНК.
 
3.2. Изучение взаимосвязи между транскрипцией, трансляцией, репликацией и действием Аргонавт-зависимых систем у бактерий. Анализ роли сцепленных с Аргонавтами нуклеаз в действии Аргонавтов in vivo. Изучение влияния Аргонавтов на транскрипцию генов-мишеней и репрессию генов. Изучение роли Аргонавтов в подавлении транспозиции мобильных генетических элементов и фаговых инфекций.
 
3.3. Разработка методов редактирования геномов и эпигеномов с использованием каталитически-активных Аргонавтов, программируемых с помощью специфических гидовых РНК или ДНК.
 
В ходе исследований получены следующие основные научные результаты:
 
1) Cозданы репортерные генетические конструкции для экспрессии сплайсированных или интрон-содержащих вариантов мРНК зеленого флуоресцентного белка. Полученные конструкции использованы для оптимизации методов анализа РНК-связывающих белков и подбора эффективных условий для очистки и выделения РНК-связывающих белков.
 
2) Проведен полномасштабный биоинформатический анализ влияния репрессивной метки хроматина H3K9me3 и белка Su(var)2-10 на регуляцию экспрессии генов. Показана необходимость H3K9me3 для экспрессии гетерохроматических генов. Установлено, что Su(var)2-10 подавляет набор генов, принимающих участие в формировании гетерохроматина. Показано, что экспрессия белок-кодирующих генов гетерохроматина регулируется петлей отрицательной обратной связи.
 
3) Исследована связь между структурой хроматина и посттранскрипционной судьбой РНК с использованием системы привлечения белков на ген-репортер на примере белка гетерохроматина HP1. Освоен метод ChIRP (сhromatin isolation by RNA purification), с помощью которого можно отслеживать загрузку РНК-связывающих белков на репортерную мРНК, транскрибированную с генов, несущих различные гистоновые модификации.
 
4) Исследована взаимосвязь между процессами репликации и репарации ДНК и действием Аргонавт-зависимых систем у бактерий. Показано, что Аргонавты, обладающие ДНК-зависимой ДНК-нуклеазной активностью, предпочтительно атакуют однонитевые участки в геноме. Обнаружены и исследованы функциональные взаимодействия между белками-Аргонавтами и системами репарации двунитевых разрывов у бактерий. Показано, что эти системы действуют совместно, что приводит к эффективному процессингу и элиминации чужеродной ДНК.  
 
5) Открыто новое явление ДНК-интерференции между гомологичными последовательностями ДНК в бактериальной клетке. Показано, что белки-Аргонавты способны расщеплять участки хромосомы, гомологичные плазмидным последовательностям, что приводит к возникновению в таких участках двунитевых разрывов. Показано, что аналогичным образом Аргонавты способны атаковать повторяющиеся последовательности в геноме, включая транспозоны и многокопийные гены. Предложен механизм ДНК-интерференции, основанный на предпочтительной загрузке Аргонавтов гидовых молекул ДНК, соответствующих повторяющимся последовательным.   
 
6) На модели каталитически неактивных РНК-зависимых белков-Аргонавтов изучена взаимосвязь между процессами транскрипции и трансляции и действием белков-Аргонавтов на определенные геномные и плазмидные мишени. Показано, что загрузка белков-Аргонавтов РНК-гидами к определенным генам не только коррелирует с уровнем транскрипции, но также зависит от трансляции соответствующих мРНК и снижается при повышении ее эффективности.
 
7) Исследовано влияние белков-Аргонавтов на транскрипцию на полногеномном уровне. Показано, что при экспрессии каталитически неактивных РНК-зависимых в клетках модельных бактерий значимо изменяется уровень экспрессии некоторых мРНК, что указывает на возможную роль этих белков в регуляции транскрипции.
 
8) Изучена роль сцепленных с Аргонавтами нуклеаз в их действии на определенные генетические мишени in vivo. На модели белка RsAgo показано, что экспрессия ассоциированной нуклеазы увеличивает предпочтение белка-Аргонавта к чужеродной ДНК –  мобильным генетическим элементам и профагам, – в составе генома.
 
9) Изучено действие белков-Аргонавтов на чужеродную ДНК: плазмиды, мобильные генетические элементы, бактериофаги. Показано, что экспрессия некоторых белков-Аргонавтов может приводить к элиминации плазмид и подавлению фаговой инфекции. Показано, что белки-Аргонавты способны эффективно загружаться короткими молекулами ДНК или РНК, соответствующими чужеродной ДНК, что объясняет специфичность их действия.
 
10) Получены модифицированные варианты белков-Аргонавтов для их направленной загрузки гидовыми нуклеиновыми кислотами и привлечения к определенным участкам генома в эукариотических клетках. Проведены модельные эксперименты по направленному редактированию целевых локусов генома в культуре клеток человека с использованием белков-Аргонавтов.
 

 
Основные задачи второго этапа работ по тематике мегагранта:
 
2.1 Исследование влияния мутаций в РНК-связывающих белках на транскрипцию предшественников piРНК; получение линий клеток млекопитающих с экспрессией аффинно-меченых РНК-связывающих белков для экспериментов по профилированию РНК-белковых взаимодействий.
 
2.2. Анализ нуклеиновых кислот, связанных с белками-Аргонавтами в клетках бактерий, их полногеномное картирование и изучение механизмов, обеспечивающих специфичность действия Аргонавтов; разработка системы для анализа влияния Аргонавтов на транскрипцию; анализ каталитической активности и специфичности сцепленных с Аргонавтами нуклеаз; подготовка экспериментов по анализу роли белков-Аргонавтов в защите клеток от мобильных генетических элементов.
 
2.3. Экспрессия бактериальных белков-Аргонавтов в клетках эукариот и анализ ассоциированных нуклеиновых кислот; разработка методов загрузки белков-Аргонавтов специфическими гидовыми молекулами нуклеиновых кислот, изучение их активности и взаимодействий с химерными гидовыми РНК in vitro.
 
По каждому из разделов проекта получены следующие основные научные результаты:
 
1) Обнаружен и исследован новый белок piРНК-пути у Drosophila, Su(var)2-10, который индуцирует внесение хроматиновой модификации H3K9me3 на кластеры piРНК, что необходимо для эффективной транскрипции предшественников piРНК.
 
2) Обнаружен и охарактеризован новый геномный локус, состоящий из повторов (Varel, vasa related repeats) и ответственный за продукцию piРНК в мужских герминальных клетках Drosophila. Показано, что данный локус способствует репродуктивной изоляции между D. melanogaster и близкородственными видами.
 
3) Для изучения взаимосвязи между структурой хроматина, РНК-связывающими белками и пост-транскрипционной судьбой РНК созданы новые клеточные линии, которые экспрессируют баркодированные трансгены, интегрированные в различные участки генома, и аффинно-меченые РНК-связывающие белки. Показано, что экспрессия баркодированных трансгенов зависит от места интеграции.
 
4) Проведен расширенный биоинформатический анализ бактериальных белков-Аргонавтов в геномных базах данных. Охарактеризованы основные семейства белков-Аргонавтов и их структурные особенности. Выявлена геномная ассоциация белков-Аргонавтов с нуклеазами различных семейств, хеликазами и ДНК-связывающими белками.
 
5) Проведен анализ библиотек коротких ДНК, ассоциированных с каталитически-активными белками-Аргонавтами в клетках бактерий. Показано, что основным местом продукции коротких ДНК является область терминации репликации в хромосоме, причем в их биогенезе может принимать участие комплекс RecBCD.
 
6) Проведен анализ библиотек коротких РНК, связанных с каталитически-неактивными Аргонавтами в клетках E. coli. Показано, что обогащение определенными гидовыми РНК в целом коррелирует с уровнем транскрипции соответствующих генов.
 
7) Исследован механизм расщепления ДНК-мишеней каталитически-активными белками-Аргонавтами. Установлено, что точность разрезания ДНК-мишени исследованными белками зависит от наличия фосфатной группы на 5’-конце гидовых молекул, при этом наличие мисматчей в гидовой ДНК, а также белок SSB способны стимулировать расщепление мишеней.
 
8) Разработаны методики экспрессии и очистки ассоциированных с белками-Аргонавтами нуклеаз, начато тестирование их каталитической активности.
 
9) Получен набор ДНК-матриц, содержащих в определенных позициях поврежденные нуклеотиды, с целью дальнейшего исследования влияния повреждений на процессинг ДНК-мишеней белками-Аргонавтами.
 
10) Разработаны методы исследования роли белков-Аргонавтов в защите бактериальных клеток от мобильных генетических элементов и бактериофагов.
 
11) Созданы системы для экспрессии бактериальных белков-Аргонавтов в клетках дрожжей и млекопитающих, проведена оптимизация кодонов, добавлены последовательности для направления белков в ядро, детекции их локализации и выделения. Отработаны методы трансфекции клеток человека данными конструкциями, осуществлена успешная экспрессия белков-Аргонавтов, проведен скрининг методов, позволяющих детектировать случаи геномного редактирования.
 
12) С целью разработки подходов к направленной загрузке специфических молекул гидовых РНК в белки-Аргонавты для экспериментов по геномному редактированию получены химерные варианты белков-Аргонавтов, содержащие в своем составе РНК-связывающие домены белков бактериофагов, которые могут специфически узнавать определенные мотивы РНК. Начат анализ их взаимодействий со специфическими гидовыми РНК, содержащими данные мотивы.
 

Основные задачи первого этапа работ по тематике мегагранта включали разработку методик профилирования РНК-белковых взаимодействий у дрозофилы, а также методов интеграции множественных баркодированных трансгенов в геном клеток человека; поиск новых генов бактериальных белков-Аргонавтов и ассоциированных с ними нуклеаз; клонирование генов перспективных белков-Аргонавтов, их экспрессию, очистку из клеток E. coli и анализ каталитических активностей; подготовку генетических конструкций для экспрессии белков-Аргонавтов в клетках эукариот. Эксперименты проведены с использованием модельных культур клеток дрозофилы, человека и бактерий, а также с использованием очищенных белков и нуклеиновых кислот in vitro. Получены следующие научные результаты.
1) Клонированы генетические конструкции и получены трансгенные линии дрозофилы с экспрессией белков процессинга пиРНК, содержащих аффинные метки. На примере белков hnRNP-семейства разработана методика профилирования РНК-связывающих белков в культуре клеток человека, которая позволяет детектировать преимущественное связывание определенных РНК-транскриптов с конкретными белками.
2) Освоены методики интеграции множественных баркодированных трансгенов в геном культивируемых клеток человека, позволяющие получить значительно число линий клеток с различным местом интеграции трансгена.
3) Проведен анализ геномных баз данных с целью поиска новых генов бактериальных Аргонавтов и ассоциированных с ними белков. Найдено более 800 новых генов, что в несколько раз превышает число ранее идентифицированных представителей этого семейства. Проведена детальная классификация белков-Аргонавтов и ассоциированных факторов.
4) Создана коллекция природных мезофильных культивируемых непатогенных бактерий, содержащих белки-Аргонавты различных классов. Проведено клонирование и химический синтез генов, кодирующих белки-Аргонавты и ассоциированные с ними нуклеазы. экспрессия новых белков-Аргонавтов в клетках E. coli и их очистка.
5) Изучена каталитическая активность и РНК/ДНК-специфичность выделенных белков-Аргонавтов in vitro. Показано, что несколько из них являются ДНК-зависимыми ДНК-нуклеазами и способны с высокой эффективностью осуществлять разрезание ДНК-мишеней.
6) Разработана уникальная система для анализа специфичности действия белков-Аргонавтов in vivo с использованием таргетных плазмид, в которых можно независимо регулировать уровень репликации, транскрипции и трансляции репортерных генов.
7) Подготовлены генетические конструкции для экспрессии каталитически активных и неактивных бактериальных белков-Аргонавтов в эукариотических клетках, которые будут использованы на следующих этапах работы для проведения экспериментов с культурами клеток человека.
 

 
В 2019 г. результаты работы лаборатории были представлены на следующих конференциях:
 
1. 1. Конференция “84th Symposium: RNA Control & Regulation”, Cold Spring Harbor Laboratory, США, 29 мая – 3 июня 2019 г.
В конференции приняли участие А.А. Аравин с докладом «Programmable DNA and RNA processing by prokaryotic Argonaute proteins» и Б.К. Годнеева с докладом «The SUMO ligase Su(var)2-10 induces co-transcriptional repression of piRNA target»
 
2. Конференция “The 44th FEBS congress”, Краков, Польша, 6-11 июля 2019 г.
В конференции приняли участие Д.М. Есюнина, Е.В. Кропочева, А.В. Кульбачинский, А.В. Олина и Д.А. Юдин с докладами «Catalytically active Argonaute nuclease from Synechococcus elongatus», «Various modes of nucleic acid processing by mesophilic bacterial Argonaute proteins», «Ago nucleases from Clostridium butyricum and Limnothrix rosea can process DNA substrates at moderate temperatures» и «Insights into genomic DNA sampling by prokaryotic Argonaute proteins».
 
3. Конференция “VI Съезд биохимиков России”, Сочи-Дагомыс, 1-6 октября 2019 г.
В конференции приняли участие А.Д. Огиенко, Л.А. Лисицкая, Е.В. Кропочева, А.В. Олина, Д.М. Есюнина, А.В. Кульбачинский с докладами «Исследование нового каталитически неактивного РНК-зависимого белка-аргонавта RzAgo», «Разработка системы in vitro для изучения влияния белка-аргонавта Rhodobacter sphaeroides на транскрипцию», «Необычная субстратная специфичность белка-аргонавта из мезофильной бактерии», «Новый белок-аргонавт из мезофильной цианобактерии Synechococcus elongatus», «Как белки-аргонавты узнают свои мишени?», «ДНК-интерференция и белки-аргонавты в клетках бактерий».
 
В 2018 г. результаты работы лаборатории были представлены на следующих конференциях:
 
1. Конференция “Международный конгресс CRISPR-2018”, Новосибирск, Россия, 10-14 сентября 2018 г.
В конференции приняли участие Кульбачинский А.В. с устным докладом «Бактериальные белки-Аргонавты как потенциальный инструмент для редактирования геномов» и Кропочева Е.В. с постерным докладом «Исследование нуклеазной активности белка-Аргонавта из мезофильной бактерии Kurthia massiliensis»
 
2. Конференция “The 43rd FEBS congress”, Прага, Чехия, 7-12 июля 2018 г.
В конференции приняли участие Кропочева Е.В. с постерным докладом «Functional activities of DNA-guided and RNA-guided bacterial Argonaute proteins», Юдин Д.А. с постерным докладом «Catalytically active Argonaute proteins from mesophilic bacteria» и Лисицкая Л.А. с постерным докладом на тему «Interactions of a bacterial Argonaute protein with DNA targets in vitro»
 
3. Конференция “Microsymposium on Small RNAs”, Вена, Австрия, 18-20 июня 2018 г.
В конференции принял участие Котов А.А. с постерным докладом «Analysis of piRNAs from AT-chX loci in the testes of Drosophila melanogaster»
 
4. Конференция “Chromosome-2018”, Новосибирск, Россия, 20-24 августа 2018 г.
В конференции приняла участие Годнеева Б.К. с постерным докладом «The role of the SUMO ligase Su(var)2-10 in deposition of repressive chromatin marks and the piRNA pathway»
 
5. Конференция “The 11th International Conference on Ribosome Synthesis“, Орфорд, Канада, 1-5 августа 2018 г.
В конференции приняла участие Фефелова Е.А. с постерным докладом «Repression of ribosomal genes in Drosophila»
 
6. Конференция «Постгеном'2018», Казань, Россия, 29 октября – 2 ноября 2018 г.
В рамках данной конференции Кульбачинский А.В. представил приглашенный доклад на тему «В поисках геномных мишеней бактериальных белков-Аргонавтов»
 
7. Конференция «Regulatory and non-coding RNAs», Cold Spring Harbor Laboratory, Нью-Йорк, США, 15-19 мая 2018 г.
В конференции приняла участие Есюнина Д.М. с устным докладом «Prokaryotic Argonaute – how it finds a target and what happens after?»
 
8. Научная школа «XIX Зимняя молодежная школа ПИЯФ по биофизике и молекулярной биологии», Санкт-Петербург (пос. Рощино), Россия, 17-22 февраля 2018 г.
В конференции приняла участие Лисицкая Л.А. с устным докладом «Изучение взаимодействия белка-Аргонавта Rhodobacter sphaeroides с ДНК-мишенями»
 
В 2017 г. результаты работы лаборатории представлены на 2-х международных конференциях:
 
1) “13th International Conference on Drosophila Heterochromatin”, Кальяри, Италия, 4-10 июня 2017 г. – А.А. Аравин, приглашенный устный доклад.
https://hc2017.azuleon.org/programme.php
 
2) “Noncoding Genome”, Гейдельберг, 14-17 сентября 2017 г. – Д.М. Есюнина, устный доклад.
https://www.embo-embl-symposia.org/symposia/2017/EES17-07/programme/inde...