Лаборатория биологии РНК и эпигенетики | Институт молекулярной генетики РАН

Аравин Алексей Алексеевич

Аравин Алексей Алексеевич
Заведующий лабораторией
Ученая степень:
кандидат биологических наук
Ученое звание:
без ученого звания
Адрес электронной почты:
Телефон:
   
   
Лаборатория создана в 2017 г. при поддержке «мегагранта» Правительства Российской Федерации для государственной поддержки научных исследований, проводимых под руководством ведущих ученых в российских образовательных организациях высшего образования, научных учреждениях, подведомственных Федеральному агентству научных организаций, и государственных научных центрах Российской Федерации (конкурс 2016 года, V очередь: http://p220.ru/phocadownload/win5.pdf); соглашение № 14.W03.31.0007 от 28 февраля 2017 г.).
Направление научного исследования: Молекулярные механизмы РНК-интеференции и защиты геномов у бактерий и эукариот.
Лаборатория оснащена современным оборудованием и активно сотрудничает с ведущими научными коллективами в России и за рубежом.
   
   

Список сотрудников

Персональный состав научного коллектива лаборатории:
Аравин А.А. – к.б.н., зав. лаб., ИМГ РАН
Кульбачинский А.В. – д.б.н., с.н.с., зам. зав. лаб., ИМГ РАН
Агапов А.А. – вед. инж. ИМГ РАН, аспирант МГУ имени М.В. Ломоносова
Есюнина Д.М. – к.б.н., с.н.с. ИМГ РАН
Коган Г.Л. – к.б.н., с.н.с. ИМГ РАН
Котов А.А. – к.б.н., м.н.с. ИМГ РАН
Кудинова А.Г. – к.б.н., м.н.с. ИМГ РАН
Кузьменко А.В. – к.б.н., н.с. ИМГ РАН
Логутенкова Т.С. – вед. инж. ИМГ РАН
Миропольская Н.А. – к.б.н., с.н.с. ИМГ РАН
Огиенко А.Д. – инж. 1 кат. ИМГ РАН, магистрант МГУ имени М.В. Ломоносова
Петрова М.А. – д.б.н., зав. сектором ИМГ РАН
Рязанский С.С. – к.б.н., н.с. ИМГ РАН
Юдин Д.А. – инж. 1 кат. ИМГ РАН, магистрант МГУ имени М.В. Ломоносова
 
Веселкина Е.Р. – аспирант ИМГ РАН
Годнеева Б.К. – аспирант ИМГ РАН
Кропочева Е.В. – аспирант ИМГ РАН
Лисицкая Л.А. – аспирант ИМГ РАН
Олина А.В. – аспирант ИМГ РАН
Фефелова Е.А. – аспирант ИМГ РАН
Шилкин Е.С. – аспирант ИМГ РАН

 

  Нажмите на картинку для увеличения   Нажмите на картинку для увеличения
  Нажмите на картинку для увеличения Нажмите на картинку для увеличения

 

   
   

Основные направления исследований

Целью работы лаборатории является изучение механизмов образования и функций некодирующих РНК у прокариот и эукариот. Короткие некодирующие РНК – важные компоненты геномов эукариот, которые участвуют в подавлении активности генов по механизмам РНК-интерференции (РНКи). РНКи является мощным инструментом для анализа функций генов в фундаментальных исследованиях и имеет большие перспективы применения в терапии заболеваний человека. В работах А.А.Аравина сделано несколько важнейших открытий о роли некодирующих РНК в подавлении активности мобильных генетических элементов у животных. Несколько лет назад под руководством А.А.Аравина были впервые изучены системы РНК-интерференции у бактерий и показано их определенное сходство с системами эукариот. В частности, ключевую роль в обоих случаях играют белки семейства аргонавтов. Однако механизмы образования коротких РНК и их функции в регуляции экспрессии генов как у эукариот, так и у прокариот, остаются во многом неисследованными. Задачей лаборатории является изучение природных функций систем РНК-интерференции и некодирующих РНК у бактерий и эукариот, а также разработка новых инструментов для геномной и эпигеномной инженерии на основе данных систем.
 
Основные направления исследований ЛБРиЭ:
1) Изучение механизма биогенеза некодирующих РНК у эукариот и их роли в регулировании транскрипции и структуры хроматина.
2) Изучение функций и механизмов РНК-интерференции у бактерий.
3) Разработка новых подходов к редактированию генома с использованием некодирующих РНК и белков-Аргонавтов.
 
В результате выполнения исследований будут изучены детальные механизмы процессинга коротких РНК и их связь со структурой хроматина у эукариот, выяснены механизмы и функции систем РНК- и ДНК-интерференции у бактерий, а также созданы новые инструменты для редактирования эукариотических геномов.
 
  Нажмите на картинку для увеличения
 
Модель действия бактериального белка-Аргонавта RsAgo: образование коротких гидовых РНК и расщепление плазмиды-мишени (по Olovnikov et al., 2013)
 
 
 
  Нажмите на картинку для увеличения
Модель биогенеза piRNA у дрозофилы и связь этого процесса с транскрипцией и структурой хроматина
 
 
   
   

Основные результаты исследований в 2018 году

 
Основные задачи второго этапа работ по тематике мегагранта:
 
2.1 Исследование влияния мутаций в РНК-связывающих белках на транскрипцию предшественников piРНК; получение линий клеток млекопитающих с экспрессией аффинно-меченых РНК-связывающих белков для экспериментов по профилированию РНК-белковых взаимодействий.
 
2.2. Анализ нуклеиновых кислот, связанных с белками-Аргонавтами в клетках бактерий, их полногеномное картирование и изучение механизмов, обеспечивающих специфичность действия Аргонавтов; разработка системы для анализа влияния Аргонавтов на транскрипцию; анализ каталитической активности и специфичности сцепленных с Аргонавтами нуклеаз; подготовка экспериментов по анализу роли белков-Аргонавтов в защите клеток от мобильных генетических элементов.
 
2.3. Экспрессия бактериальных белков-Аргонавтов в клетках эукариот и анализ ассоциированных нуклеиновых кислот; разработка методов загрузки белков-Аргонавтов специфическими гидовыми молекулами нуклеиновых кислот, изучение их активности и взаимодействий с химерными гидовыми РНК in vitro.
 
По каждому из разделов проекта получены следующие основные научные результаты:
 
1) Обнаружен и исследован новый белок piРНК-пути у Drosophila, Su(var)2-10, который индуцирует внесение хроматиновой модификации H3K9me3 на кластеры piРНК, что необходимо для эффективной транскрипции предшественников piРНК.
 
2) Обнаружен и охарактеризован новый геномный локус, состоящий из повторов (Varel, vasa related repeats) и ответственный за продукцию piРНК в мужских герминальных клетках Drosophila. Показано, что данный локус способствует репродуктивной изоляции между D. melanogaster и близкородственными видами.
 
3) Для изучения взаимосвязи между структурой хроматина, РНК-связывающими белками и пост-транскрипционной судьбой РНК созданы новые клеточные линии, которые экспрессируют баркодированные трансгены, интегрированные в различные участки генома, и аффинно-меченые РНК-связывающие белки. Показано, что экспрессия баркодированных трансгенов зависит от места интеграции.
 
4) Проведен расширенный биоинформатический анализ бактериальных белков-Аргонавтов в геномных базах данных. Охарактеризованы основные семейства белков-Аргонавтов и их структурные особенности. Выявлена геномная ассоциация белков-Аргонавтов с нуклеазами различных семейств, хеликазами и ДНК-связывающими белками.
 
5) Проведен анализ библиотек коротких ДНК, ассоциированных с каталитически-активными белками-Аргонавтами в клетках бактерий. Показано, что основным местом продукции коротких ДНК является область терминации репликации в хромосоме, причем в их биогенезе может принимать участие комплекс RecBCD.
 
6) Проведен анализ библиотек коротких РНК, связанных с каталитически-неактивными Аргонавтами в клетках E. coli. Показано, что обогащение определенными гидовыми РНК в целом коррелирует с уровнем транскрипции соответствующих генов.
 
7) Исследован механизм расщепления ДНК-мишеней каталитически-активными белками-Аргонавтами. Установлено, что точность разрезания ДНК-мишени исследованными белками зависит от наличия фосфатной группы на 5’-конце гидовых молекул, при этом наличие мисматчей в гидовой ДНК, а также белок SSB способны стимулировать расщепление мишеней.
 
8) Разработаны методики экспрессии и очистки ассоциированных с белками-Аргонавтами нуклеаз, начато тестирование их каталитической активности.
 
9) Получен набор ДНК-матриц, содержащих в определенных позициях поврежденные нуклеотиды, с целью дальнейшего исследования влияния повреждений на процессинг ДНК-мишеней белками-Аргонавтами.
 
10) Разработаны методы исследования роли белков-Аргонавтов в защите бактериальных клеток от мобильных генетических элементов и бактериофагов.
 
11) Созданы системы для экспрессии бактериальных белков-Аргонавтов в клетках дрожжей и млекопитающих, проведена оптимизация кодонов, добавлены последовательности для направления белков в ядро, детекции их локализации и выделения. Отработаны методы трансфекции клеток человека данными конструкциями, осуществлена успешная экспрессия белков-Аргонавтов, проведен скрининг методов, позволяющих детектировать случаи геномного редактирования.
 
12) С целью разработки подходов к направленной загрузке специфических молекул гидовых РНК в белки-Аргонавты для экспериментов по геномному редактированию получены химерные варианты белков-Аргонавтов, содержащие в своем составе РНК-связывающие домены белков бактериофагов, которые могут специфически узнавать определенные мотивы РНК. Начат анализ их взаимодействий со специфическими гидовыми РНК, содержащими данные мотивы.
 
   
   

Основные результаты исследований в 2017 году

Основные задачи первого этапа работ по тематике мегагранта включали разработку методик профилирования РНК-белковых взаимодействий у дрозофилы, а также методов интеграции множественных баркодированных трансгенов в геном клеток человека; поиск новых генов бактериальных белков-Аргонавтов и ассоциированных с ними нуклеаз; клонирование генов перспективных белков-Аргонавтов, их экспрессию, очистку из клеток E. coli и анализ каталитических активностей; подготовку генетических конструкций для экспрессии белков-Аргонавтов в клетках эукариот. Эксперименты проведены с использованием модельных культур клеток дрозофилы, человека и бактерий, а также с использованием очищенных белков и нуклеиновых кислот in vitro. Получены следующие научные результаты.
1) Клонированы генетические конструкции и получены трансгенные линии дрозофилы с экспрессией белков процессинга пиРНК, содержащих аффинные метки. На примере белков hnRNP-семейства разработана методика профилирования РНК-связывающих белков в культуре клеток человека, которая позволяет детектировать преимущественное связывание определенных РНК-транскриптов с конкретными белками.
2) Освоены методики интеграции множественных баркодированных трансгенов в геном культивируемых клеток человека, позволяющие получить значительно число линий клеток с различным местом интеграции трансгена.
3) Проведен анализ геномных баз данных с целью поиска новых генов бактериальных Аргонавтов и ассоциированных с ними белков. Найдено более 800 новых генов, что в несколько раз превышает число ранее идентифицированных представителей этого семейства. Проведена детальная классификация белков-Аргонавтов и ассоциированных факторов.
4) Создана коллекция природных мезофильных культивируемых непатогенных бактерий, содержащих белки-Аргонавты различных классов. Проведено клонирование и химический синтез генов, кодирующих белки-Аргонавты и ассоциированные с ними нуклеазы. экспрессия новых белков-Аргонавтов в клетках E. coli и их очистка.
5) Изучена каталитическая активность и РНК/ДНК-специфичность выделенных белков-Аргонавтов in vitro. Показано, что несколько из них являются ДНК-зависимыми ДНК-нуклеазами и способны с высокой эффективностью осуществлять разрезание ДНК-мишеней.
6) Разработана уникальная система для анализа специфичности действия белков-Аргонавтов in vivo с использованием таргетных плазмид, в которых можно независимо регулировать уровень репликации, транскрипции и трансляции репортерных генов.
7) Подготовлены генетические конструкции для экспрессии каталитически активных и неактивных бактериальных белков-Аргонавтов в эукариотических клетках, которые будут использованы на следующих этапах работы для проведения экспериментов с культурами клеток человека.
 
    
    

Семинары и конференции

 
В 2018 г. результаты работы лаборатории были представлены на следующих конференциях:
 
1. Конференция “Международный конгресс CRISPR-2018”, Новосибирск, Россия, 10-14 сентября 2018 г.
В конференции приняли участие Кульбачинский А.В. с устным докладом «Бактериальные белки-Аргонавты как потенциальный инструмент для редактирования геномов» и Кропочева Е.В. с постерным докладом «Исследование нуклеазной активности белка-Аргонавта из мезофильной бактерии Kurthia massiliensis»
 
2. Конференция “The 43rd FEBS congress”, Прага, Чехия, 7-12 июля 2018 г.
В конференции приняли участие Кропочева Е.В. с постерным докладом «Functional activities of DNA-guided and RNA-guided bacterial Argonaute proteins», Юдин Д.А. с постерным докладом «Catalytically active Argonaute proteins from mesophilic bacteria» и Лисицкая Л.А. с постерным докладом на тему «Interactions of a bacterial Argonaute protein with DNA targets in vitro»
 
3. Конференция “Microsymposium on Small RNAs”, Вена, Австрия, 18-20 июня 2018 г.
В конференции принял участие Котов А.А. с постерным докладом «Analysis of piRNAs from AT-chX loci in the testes of Drosophila melanogaster»
 
4. Конференция “Chromosome-2018”, Новосибирск, Россия, 20-24 августа 2018 г.
В конференции приняла участие Годнеева Б.К. с постерным докладом «The role of the SUMO ligase Su(var)2-10 in deposition of repressive chromatin marks and the piRNA pathway»
 
5. Конференция “The 11th International Conference on Ribosome Synthesis“, Орфорд, Канада, 1-5 августа 2018 г.
В конференции приняла участие Фефелова Е.А. с постерным докладом «Repression of ribosomal genes in Drosophila»
 
6. Конференция «Постгеном'2018», Казань, Россия, 29 октября – 2 ноября 2018 г.
В рамках данной конференции Кульбачинский А.В. представил приглашенный доклад на тему «В поисках геномных мишеней бактериальных белков-Аргонавтов»
 
7. Конференция «Regulatory and non-coding RNAs», Cold Spring Harbor Laboratory, Нью-Йорк, США, 15-19 мая 2018 г.
В конференции приняла участие Есюнина Д.М. с устным докладом «Prokaryotic Argonaute – how it finds a target and what happens after?»
 
8. Научная школа «XIX Зимняя молодежная школа ПИЯФ по биофизике и молекулярной биологии», Санкт-Петербург (пос. Рощино), Россия, 17-22 февраля 2018 г.
В конференции приняла участие Лисицкая Л.А. с устным докладом «Изучение взаимодействия белка-Аргонавта Rhodobacter sphaeroides с ДНК-мишенями»
 
В 2017 г. результаты работы лаборатории представлены на 2-х международных конференциях:
 
1) “13th International Conference on Drosophila Heterochromatin”, Кальяри, Италия, 4-10 июня 2017 г. – А.А. Аравин, приглашенный устный доклад.
https://hc2017.azuleon.org/programme.php
 
2) “Noncoding Genome”, Гейдельберг, 14-17 сентября 2017 г. – Д.М. Есюнина, устный доклад.
https://www.embo-embl-symposia.org/symposia/2017/EES17-07/programme/inde...
 
 
   
   

Основные публикации

  1. Ryazansky S., Kulbachinskiy A., Aravin A.A. 2018. The Expanded Universe of Prokaryotic Argonaute Proteins. MBio 9(6). pii: e01935-18. doi: 10.1128/mBio.01935-18.
  2. Lisitskaya L, Aravin AA, Kulbachinskiy A. 2018. DNA interference and beyond: structure and functions of prokaryotic Argonaute proteins. Nat Commun. 9(1): 5165. doi: 10.1038/s41467-018-07449-7.
  3. Pupov D., Ignatov A., Agapov A., Kulbachinskiy A. 2019. Distinct effects of DNA lesions on RNA synthesis by Escherichia coli RNA polymerase. Biochem. Biophys. Res. Commun. In press.
  4. Liu Y, Esyunina D, Olovnikov I, Teplova M, Kulbachinskiy A, Aravin AA, Patel DJ. 2018. Accommodation of Helical Imperfections in Rhodobacter sphaeroides Argonaute Ternary Complexes with Guide RNA and Target DNA. Cell Rep. 24: 453-462.
  5. Олина А.В., Кульбачинский А.В., Аравин А.А., Есюнина Д.М. 2018. Белки-аргонавты и механизмы РНК-интерференции у эукариот и прокариот. Биохимия 83: 645-661.
 
Избранные публикации сотрудников ЛБРиЭ (2012-2017 гг., до создания ЛБРиЭ):
  1. Miropolskaya N., Esyunina D., Kulbachinskiy A. 2017. Conserved functions of the trigger loop and Gre factors in RNA cleavage by bacterial RNA polymerases. J. Biol. Chem. 292: 6744-6752.
  2. Petushkov I., Esyunina D., Kulbachinskiy A. 2017. s38-dependent promoter-proximal pausing by bacterial RNA polymerase. Nucleic Acids Res. 45: 3006-3016.
  3. Ryazansky S, Radion E, Mironova A, Akulenko N, Abramov Y, Morgunova V, Kordyukova MY, Olovnikov I, Kalmykova A. 2017. Natural variation of piRNA expression affects immunity to transposable elements. PLoS Genet. 13: e1006731.
  4. Y. Chen, E. Stuwe, Y. Luo, M. Ninova, A. Le Thomas, E. Rozhavskaya, S. Li, S. Vempati, J. Laver, D. Patel, C. Smibert, H. Lipshitz, K. Fejes Tóth and A. Aravin. 2016. Cutoff suppresses RNA polymerase II termination to ensure expression of piRNA precursors. Molecular Cell 63: 97-109.
  5. J. Hur, Y. Luo, S. Moon, M. Ninova, G. Marinov, Y. Chung and A. Aravin. 2016. Splicing-independent loading of TREX on nascent RNA is required for efficient expression of dual-strand piRNA clusters in Drosophila. Genes & Development. 30: 840-855.
  6. Esyunina D., Agapov A., Kulbachinskiy A. 2016. Regulation of transcriptional pausing through the secondary channel of RNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 113: 8699-8704.
  7. Esyunina D., Turtola M., Pupov D., Bass I., Klimašauskas S., Belogurov G., Kulbachinskiy A. 2016. Lineage-specific variations in the trigger loop modulate RNA proofreading by bacterial RNA polymerases. Nucleic Acids Res. 44: 1298-1308.
  8. Kuzmenko, A., Derbikova, K., Salvatori, R., Tankov, S., Atkinson, G. C., Tenson, T., Ott, M., Kamenski, P., and Hauryliuk, V. 2016. Aim-less translation: loss of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial translation initiation factor mIF3/Aim23 leads to unbalanced protein synthesis. Scientific Reports 6: 18749.
  9. Ryazansky SS, Kotov AA, Kibanov MV, Akulenko NV, Korbut AP, Lavrov SA, Gvozdev VA, Olenina LV. 2016. RNA helicase Spn-E is required to maintain Aub and AGO3 protein levels for piRNA silencing in the germline of Drosophila. Eur J Cell Biol. 95: 311-22.
  10. A. Webster, S. Li, J. Hur, M. Wachsmuth, J. Bois, E. Perkins, D. Patel and A. Aravin. 2015. Aub and Ago3 are recruited to nuage through two mechanisms to form a ping-pong complex assembled by Krimper. Molecular Cell. 59: 564-575.
  11. S. Manakov, D. Pezic, G. Marinov, W. Pastor, R. Sachidanandam and A. Aravin. 2015. MIWI2 and MILI have differential effects on piRNA biogenesis and DNA methylation. Cell Reports. 12: 1234-1243.
  12. Esyunina D., Klimuk E., Severinov K., Kulbachinskiy A. 2015. Distinct pathways of RNA polymerase regulation by a phage-encoded factor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112: 2017-2022.
  13. Miropolskaya N., Esyunina D., Klimašauskas S., Nikiforov V., Artsimovitch I., Kulbachinskiy A. 2014. Interplay between the trigger loop and the F loop during RNA polymerase catalysis. Nucl. Acids Res. 42: 544-552.
  14. Le Thomas A., Stuwe E., Li S., Du J., Marinov G., Rozhkov N., Chen YC, Luo Y., Sachidanandam R., Fejes Tóth K., Patel D., Aravin A. 2014. Transgenerationally inherited piRNAs trigger piRNA biogenesis by changing the chromatin of piRNA clusters and inducing precursor processing. Genes & Development 28:1667-1680.
  15. Kuzmenko A, Atkinson GC, Levitskii S, Zenkin N, Tenson T, Hauryliuk V, Kamenski P. 2014. Mitochondrial translation initiation machinery: conservation and diversification. Biochimie 100: 132-140.
  16. Miropolskaya N., Ignatov A., Bass I., Zhilina E., Pupov D., Kulbachinskiy A. 2012. Distinct functions of regions 1.1 and 1.2 of RNA polymerase s subunits from Escherichia coli and Thermus aquaticus in transcription initiation. J. Biol. Chem. 287: 23779-23789.